Utilisation d`un composant dédié incorporé dans le logiciel d`acquisition et la motorisation à grande vitesse proposée (matériaux et méthodes SI et Fig. S2 A et B), la distance radiale r et la longueur d`onde d`excitation peuvent être modifiées en moins de 1 ms, ce qui permet d`adapter la profondeur de pénétration à la longueur d`onde d`excitation ou de créer des protocoles d`acquisition avancés tout en utilisant simultanément l`exposition et lecture (mode ”chevauchement en continu”). Comme illustré dans la partie droite de la Fig. S1B, acquisition classique de TIRF où les angles azimutaux et d`incidence sont fixés (en haut à gauche) ou l`acquisition de filature azimutale avec un angle d`incidence fixe (en bas à gauche) sont accessibles. Pour les cas plus complexes, tels que l`acquisition de laps de temps en utilisant la réflexion interne totale séquentielle (cercle externe) et le champ large oblique (WF) (cercle intérieur), l`illumination peut être effectuée comme indiqué dans le schéma en haut à droite de la Fig. S1B. Enfin, un protocole d`acquisition de la TIRF où la profondeur de pénétration est adaptée pour deux longueurs d`onde différentes est illustrée par le dernier schéma (Fig. 1B, en bas à droite). Dans ce cas, les deux canaux peuvent être détectés simultanément à l`aide d`un périphérique multicanal tout en scannant les deux cercles colorés l`un après l`autre dans le même temps d`exposition. Notez que l`un des cercles peut correspondre à un angle d`incidence sous l`angle critique et conduit à l`imagerie WF et TIRF simultanée de deux entités moléculaires distinctes. Les principes de TIRFM suggèrent qu`en variant l`angle d`incidence de l`illumination, et par conséquent la profondeur de pénétration de l`onde évanescent, les fluorophores peuvent être distingués par la profondeur à une échelle nanométrique.

Cette technique de contrôle précis de la profondeur de pénétration est plus facile à réaliser dans les systèmes de type prisme, et une récente amélioration technique de la méthode est l`utilisation de déflecteurs acousto-optiques (AOD) pour modifier rapidement l`angle d`incidence. Par variation rapide de la profondeur de champ évanescent, les vésicules cibles ou d`autres structures peuvent être suivies à différentes profondeurs et leurs positions déterminées avec précision. Il existe un certain nombre d`applications potentiellement utiles des AOD dans TIRFM, y compris l`utilisation comme volets extrêmement rapides qui peuvent rapidement moduler la longueur d`onde d`illumination dans les systèmes équipés de laser multi-ligne. Modules d`éclairage pour l`ajout de la capacité de photostimulation (conversion/activation), FRAP et TIRF aux systèmes d`imagerie Nikon. Il ya un débat plus si il est nécessaire d`utiliser des angles de longueur d`onde spécifiques d`incidence lors de l`exécution de TIRFM à plusieurs longueurs d`onde. La réponse peut être atteinte en effectuant une expérience simple, mais d`abord il est important de comprendre comment la longueur d`onde d`excitation affecte la profondeur de pénétration d`onde évanescent, qui peut facilement être visualisée en effectuant quelques calculs utilisant l`équation 2 [d = λ 0/4 π (n22 sin2θ − n12)-1/2]. Les calculs ci-dessous sont basés sur un objectif de 60X 1,45 NA pour lequel θcritical = 65,22 ° et θmaximum = 72,54 ° (en utilisant n2 = 1,52 et N1 = 1,38). Le concept de base de TIRFM en microscopie cellulaire est simple: un faisceau lumineux d`excitation doit se déplacer à un angle d`incident élevé à travers une lèvre de verre sur laquelle les cellules sont cultivées. L`indice de réfraction (RI; Voir le tableau 1 pour les indices de réfraction de certains réactifs courants) les différences entre le verre (N2) et l`intérieur de la cellule intacte (N1) régissent la façon dont la lumière est réfractée ou réfléchie à l`interface en fonction de l`angle de l`incident. À un angle critique spécifique (θcritique), le faisceau de lumière est totalement reflété par l`interface verre/eau, plutôt que par le passage et la réaction (équation 1; Fig. 2A). La réflexion génère un champ électromagnétique très mince (la vague évanescent) sur le côté cellulaire de la lamelle qui a une fréquence identique à celle de la lumière incidente.

La profondeur de l`onde évanescent est fonction de l`angle d`illumination de l`incident, de la longueur d`onde et des différences d`indice de réfraction (équation 2) et son intensité se désintègre exponentiellement avec la distance du verre de couverture (équation 3; Fig. 2B).